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          1. NRPB07S Ni-IDA琼脂糖凝胶FF预装柱

            发布日期:2020-10-27 阅读次数:2236

            品  名:Ni-IDA琼脂糖凝胶FF

            英文名:Nickel Iminodiacetic acid NUPharose Fast FlowNi-IDA NUPharose FF

            目录号:NRPB07L .NRPB07S(预装柱)

            规  格:20 ml100 ml1 L1 ml预装柱特殊规格订制

            运  输:2 ~ 30℃常压 .避光

            贮  存:20%乙醇2 ~ 25℃

            保质期:5.


            相关介绍: 

            镍-琼脂糖凝胶FF以琼脂糖微球为基质通过活化偶联亚氨基2乙酸(IDA)再螯合Ni2+.其中IDA是金属螯合层析中最常用的配体与次氮基3乙酸(NTA)相比具有亲和力强载量高可再生重复使用的特点.

            镍-琼脂糖凝胶FF主要用于纯化带组氨酸标签(His-Tag)的重组蛋白.纯化原理是利用重组蛋白组氨酸标签的咪唑环可与过渡金属Ni2+形成稳定的配位键因4芴匾 .牢固 .可逆地吸附于固定这些金属离子的基质结合了His-Tag重组蛋白的镍-琼脂糖凝胶FF1般通过增加咪唑浓度进行竞争洗脱.


            技术指标:

            基质

            4%琼脂糖凝胶

            配基

            -N(CH2COOH)2

            配基密度

            ≥25 μmol/ml

            填料粒径

            60 ~ 180 μm

            好的流速

            800 cm/h

            推荐流速

            50 ~ 100 cm/h

            pH稳定性

            pH 5 ~ 12pH 3 ~ 14(脱镍)

            耐反压

            0.3 MPa

            载量

            ≥40 mg His-tag重组蛋白/ml 


            使用方法:

            1.色谱柱装填

            1.1 所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度1至液体好的做脱气处理.

            1.2 于柱子下端加入蒸馏水以除去柱子中的空气关闭柱子出口于柱内保留少量的蒸馏水.

            1.3 将琼脂糖凝胶连续倒入柱子时要用玻璃棒的紧靠柱子内壁引流以减少气泡的产生让填料先自然沉降.

            1.4 柱压不超过0.3 MPa如果装柱系统中无法测柱压则控制流速高于300 cm/h但是于使用中1般只用好的流速的75%.

            1.5填装好的镍-琼脂糖凝胶FF柱用2 ~ 5个柱体积的初始缓冲溶液平衡建议流速100 cm/h平衡后的柱子可以用于His-Tag重组蛋白的上样和洗脱纯化.

            2.上样

            2.1 样品1般溶解于pH6 ~ 8的初始缓冲液中提高上样缓冲液的pH值可以增大载量.

            2.2 缓冲液中不能含有EDTA和柠檬酸盐也好的不含巯基乙醇 .DTT等还原剂.

            2.3常用缓冲液有10 ~ 100 mM 磷酸钠缓冲液 .20 ~ 200 mM Tris-HCl缓冲液等.

            2.4于缓冲液中1般要加入0.15 ~ 0.5 M的NaCl以消除离子交换作用.

            2.5于初次使用镍-琼脂糖凝胶FF推荐使用50 mM PBS(50 mM NaH2PO40.5 M NaClNaOH调节pH 7.4)作为初始缓冲液.

            3. 洗脱

            3.1 镍-琼脂糖凝胶FF最常用的洗脱方法为增加咪唑浓度进行洗脱.

            3.2咪唑为碱性相应缓冲液配制后需要用HCl进行调节pH.

            3.3于初次使用镍-琼脂糖凝胶FF不知道洗脱的咪唑浓度推荐于初始缓冲液中分别加入10 mM .20 mM .50 mM .100 mM .200 mM .500 mM咪唑浓度从低到高分别洗脱和收集通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定.

            3.4 有条件的也可以进行线性咪唑梯度洗脱确定较佳洗脱条件.


            拓展应用:

            1. 更换不同的螯合离子

            1.1 IDA螯合的镍-琼脂糖凝胶FF可以用EDTA脱掉镍脱掉镍后可以用0.1 ~ 1.0M NaOH进行清洗凝胶再重新螯合镍使凝胶焕然1新.也可以螯合其他金属离子如Cu2+Zn2+Co2+Fe3+等进行多样纯化.

            1.2 脱镍方法:用5 ~ 10个柱体积蒸馏水淋洗柱子再用5 ~ 10个柱体积的100 mM EDTA淋洗柱子再用2 ~ 3个柱体积的0.5 M NaCl洗掉残留的EDTA.

            1.3螯合金属离子方法:用2 ~ 5个柱体积的蒸馏水充分平衡脱镍的柱子用0.1 ~ 0.3M金属盐溶液过柱5 ~ 10个柱体积螯合金属螯合后用5 ~ 10个柱体积蒸馏水淋洗去除未螯合的金属离子.

            1.4 金属盐可以为硫酸盐或盐酸盐如为NiSO4 .CuSO4 .ZnSO4 .CoCl2 .PbSO4等金属盐溶液应中性或弱酸性且必须经过过滤以防止金属盐于胶上沉淀.

            1.5 如果是Fe3+必须于低pH下螯合(pH 3)以防止Fe3+产生沉淀1般可以加入少量盐酸和硫酸保持pH.

            2. 多种洗脱方法

            2.1 降低pH洗脱:大多数蛋白于pH 4 ~ 6会被洗脱下来也可以于pH 3 ~ 4缓冲液可以是醋酸钠 .柠檬酸或磷酸盐缓冲体系.

            2.2 竞争性洗脱:线性增加或1步增加与金属离子有亲和力的物质如0 ~ 0.5 M咪唑0 ~ 50 mM组氨酸0 ~ 2 M NH4Cl.梯度洗脱好的于起始缓冲液的恒定pH下进行.

            2.3 螯合剂洗脱:EDTA .EGTA等螯合剂会与金属离子产生作用力导致蛋白被洗脱下来.这种方法不能使不同的蛋白分离此外会影响蛋白吸附导致融合蛋白不能挂柱.

            2.4 所有上述情况中缓冲液中必须加入0.15 ~ 0.5 M的NaCl 以消除离子交换作用.

            2.5 当螯合离子配基是Cu2+时有以下的3种操作方式.

            降低pH洗脱:

            上样缓冲液:50 mM NaH2PO40.5 M NaClpH 7.4

            洗脱缓冲液:50 mM NaH2PO40.5 M NaClpH 3.5

            竞争性洗脱:

            上样缓冲液:50 mM NaH2PO41 M NaClpH 7.4

            洗脱缓冲液:50 mM NaH2PO41 M NH4ClpH 7.4

            螯合剂洗脱:

            上样缓冲液:50 mM NaH2PO40.5 M NaClpH 7.4

            洗脱缓冲液:50 mM NaH2PO40.5 M NaCl50 mM EDTApH 7.4

            注:配制的缓冲液需要用NaOH或HCl调节至要求的pH.使用降低pH和螯合剂洗脱会使金属离子脱落下次使用得重新螯和金属离子最常用的为竞争性洗脱.


            再生 .清洗:

            1. 凝胶的再生

            1.1 多次使用后或需要更换螯合的金属离子必须将胶脱镍再生.脱镍方法:用5 ~ 10个柱体积蒸馏水淋洗柱子再用5 ~ 10个柱体积的100 mM EDTA淋洗柱子再用2 ~ 3个柱体积的0.5 M NaCl洗掉残留的EDTA.

            1.2 多次使用的柱子脱镍后1般需要清洗.清洗方法:用0.1 ~ 1.0 M NaOH反向清洗柱子流速50 cm/h保持1 ~ 2 h能去除结合强的杂质同时也能去除热源.

            1.3 清洗后需要重新螯合金属离子.螯合方法:用2 ~ 5个柱体积的蒸馏水充分平衡脱镍的柱子用0.1 ~ 0.3M金属盐溶液过柱5 ~ 10个柱体积螯合金属螯合后用5 ~ 10个柱体积蒸馏水淋洗去除未螯合的金属离子.

            2.于位清洗

            2.1 除去因离子交换作用吸附的蛋白用2 ~ 3个柱体积2 M 的NaCl溶液反向清洗柱子.

            2.2 除去强的疏水性蛋白和脂质等用4个柱体积的70%的乙醇或者30%的异丙醇反向清洗柱子.

            2.3 除去蛋白沉淀 .疏水性蛋白参照凝胶的再生.


            注意事项:

            推荐流速

            预装柱体积

            1 ml

            5 ml

            10 ml

            流速(ml /min )

            0.2

            1

            2

            导购指南

            中文名

            英文简称

            货号

            规格

            产品描述

            重力预装柱

            Ni-IDA琼脂糖凝胶FF重力预装柱

            Ni-IDA NUPharose FF pre-packed column

            NRPB07S-Z11

            1*1mL

            1*1ml

            NRPB07S-Z41

            4*1mL

            4*1ml

            NRPB07S-Z15

            1*5mL

            1*5mL

            NRPB07S-Z25

            2*5mL

            2*5mL

            AKTA中压预装柱

            Ni-IDA琼脂糖凝胶FF中压预装柱

            Ni-IDA NUPharose FF pre-packed column

            NRPB07S-Y11

            1*1mL

            1*1ml

            NRPB07S-Y41

            4*1mL

            4*1ml

            NRPB07S-Y15

            1*5mL

            1*5mL

            NRPB07S-Y25

            2*5mL

            2*5mL

            填料

            Ni-IDA-琼脂糖凝胶FF

            Ni-IDA NUPharose FF

            NRPB07L-10

            10mL

            1*10ml

            NRPB07L-20

            20mL

            1*20ml

            NRPB07L-100

            100mL

            1*100ml

            NRPB07L-500

            500ml

            1*500ml

            注:欧洲杯竞猜生物填料体积为实际琼脂糖凝胶体积


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